Etiology เป็นคำมาจากภาษากรีก 2 คำ คือ aitia หมายถึงสาเหตุ และ ology หมายถึงวิทยา มุฏฐานของโรคจึงเป็นวิทยาศาสตร์ทางสาเหตุโรค (primary causal agent) และรวมถึงการศึกษาปัจจัยต่างๆ ที่เกี่ยวข้องทั้งทางตรง และทางอ้อม ตั้งแต่โรคเริ่มเกิดและกาฟักตัวของโรค โดยเฉพาะการศึกษาเชื้อและการจำแนกเชื้อสาเหตุ การพิสูจน์ความสามารถของเชื้อที่ทำให้เกิดโรค หลักของกลไกการเกิดโรค (pathogenesis) และชีพจักรของเชื้อโรค
ส่วนประกอบของโรค (Disease components)
ส่วนประกอบซึ่งเป็นปัจจัยสำคัญของการเกิดโรคนั้น ทราบกันดีในชื่อ “disease triangle”  ได้แก่ ต้องมีพืชอาศัยที่เป็นโรคง่าย (susceptible host) เชื้อสาเหตุที่รุนแรง (virulent and agressive pathogen) และสภาพแวดล้อมที่เหมาะสม (favorable environment) แต่ในปัจจุบันเป็นที่ ยอมรับกันแล้วว่า ส่วนประกอบของโรคมีปัจจัยเพิ่มขึ้นเป็นปัจจัยที่ 4 อีก คือ เวลา (time) จึงเปลียนเป็นแบบจำลองที่เรียกว่า “disease pyramid” (J.E. van der Plank, 1975 และ J.E. Zadoks, 1972)
สาเหตุของโรค (Causes of plant diseases)
แบ่งออกได้เป็น 3 พวกใหญ่คือ
1. สาเหตุเกิดจากสิ่งที่มีชีวิต (animate causes)
ปรสิตที่มีชีวิตในสภาพธรรมชาติ ซึ่งในวงจรชีวิตของเชื้อโรคนั้นมีการเจริญตามปกติขยายพันธุ์ได้ มี metabolism ฯลฯ ได้แก่ แมลง ไส้เดือนฝอย ไร (mites) สัตว์ชั้นสูงบางชนิด เชื้อรา บักเตรี ราเมือก ilime molds) โปรโตซัว (protozoa) สาหร่าย (algae) และพืชชั้นสูงบางชนิด

ภาพแสดงปัจจัยที่เกี่ยวข้องต่อการเกิดโรคพืช (ที่มา : Sharvelle, 1969)
2. สาเหตุเกิดจากสิ่งที่ไมมีชีวิต (inanimate causes)
สาเหตุเกิดจากสิ่งที่ไม่มีชีวิตได้แก่
ก. สภาพของดินไม่เหมาะสม เช่น ความชื้น ธาตุอาหารพืชไม่สมดุลย์ โครงสร้างของดิน ความเป็นกรดด่าง การถ่ายเทอากาศ (ออกซิเจนไม่เพียงพอ)
ข. สภาพอากาศไม่เหมาะสม เช่น แสงสว่าง อุณหภูมิ ความชื้น แรงลม ฝน หิมะ อากาศเสีย เป็นต้น
ค. การปฏิบัติต่างๆ ทางการเกษตรไม่ถูกต้อง

ภาพแสดงแบบจำลอง disease pyramid : พืชอาศัย-เชื้อสาเหตุ-สภาพแวดล้อม-เวลา (ที่มา : Browning et al. 1977)
เวลา ซึ่งเป็นปัจจัยที่ 4 นี้ ได้แก่ ระยะเวลาที่พืชอาศัยและเชื้อโรคสัมผัสกัน ระยะเวลาที่ใบเปียก ในขณะที่มีอุณหภูมิเหมาะสมต่อการเกิดโรค ระยะเวลาที่เหมาะสมต่อการแพร่กระจายของสปอร์ การงอกของสปอร์ ตลอดจนการติดเชื้อ เป็นต้น
3. สาเหตุที่เกิดจากวิสา ไวรอยด์ และมายโคพลาสมา
เป็นปรสิตที่อยู่ระหว่างสิ่งที่มีชีวิตและสิ่งที่ไม่มีชีวิต
โรคพืชนั้นอาจเป็นได้ทั้งโรคติดเชื้อ (infectious diseases) และโรคที่ไม่ใช่โรคติดเชื้อ (non-infectious or non-parasitic or physiological diseases)

ภาพไดอาแกรมแสดงรูปร่าง และขนาดของจุลินทรีย์ สาเหตุโรคต่างๆ เปรียบเทียบกับเซลพืช (ที่มา : Agrios, 1978)
โรคติดเชื้อ (Infectious diseases)
โรคติดเชื้อ เป็นโรคที่เกิดจากเชื้อที่มีชีวิตเป็นเชื้อก่อโรค (infective agent) พืชมีปฏิกริยาตอบโต้การติดเชื้อ และโรคสามารถระบาดไปยังต้นอื่นๆ ได้ หากอยู่ในสภาพแวดล้อมที่เหมาะสม ได้แก่โรคที่มีสาเหตุ ดังนี้
1. โรคเกิดจากเชื้อรา (fungal diseases)
2. โรคเกิดจากบักเตรี และริคเคทเชีย (bacterial and rickettsialike bacteria diseases)
3. โรคเกิดจากวิสา ไวรอยด์ และมายโคพลาสมา (viral,viroid and mycoplasma diseases)
4. โรคเกิดจากไส้เดือนฝอย (nematode diseases)
5. โรคเกิดจากสาหร่ายและพืชชั้นสูง (algal diseases and parasitic flowering plants or phanerogams)
6. โรคเกิดจากโปรโตซัว (protozoan diseases)
โรคที่ไม่ใช่โรคติดเชื้อ (Non – infectious diseases)
โรคที่ไม่ใช่โรคติดเชื้อ จะเป็นโรคที่เกิดจากสาเหตุที่นอกเหนือไปจากโรคติดเชื้อ โรคจะไม่สามารถระบาดจากต้นที่เป็นโรคไปยังต้นพืชปกติอื่นๆ ได้ ได้แก่
ก. สัตว์ต่างๆ แมลง นก ไร ซึ่งส่วนใหญ่จะเป็นสาเหตุทางอ้อม
ข. สภาพแวดล้อมไม่เหมาะสม
1. สภาพของดินไม่เหมาะสม ได้แก่ ความชื้น ธาตุอาหารพืช ความเป็นกรด เป็นด่าง อินทรีย์วัตถุ ชนิดและเนื้อดิน
2. สภาพอากาศไม่เหมาะสม ได้แก่ ความดันบรรยากาศ อุณหภูมิ แสงสว่าง อากาศเสีย ความชื้น แรงลม ฝน น้ำค้าง หิมะ ฯลฯ
การจำแนกโรคพืช (Classification of Plant Diseases)
พืชที่เพาะปลูกกันทั่วไป มีโรคที่พบทำความเสียหายให้นับหมื่นโรค ในพืชแต่ละชนิดจะมีโรคเกิดขึ้นได้เป็นร้อยโรค และเชื้อแต่ละชนิดที่เป็นสาเหตุของโรคก็สามารถทำให้พืชเป็นโรคได้หลายพันธุ์ หรือเป็นร้อยชนิดได้เช่นเดียวกัน เพื่อให้การศึกษาเรื่องโรคเป็นไปโดยสะดวกทางด้านการจัดหมวดหมู่เชื้อที่เป็นสาเหตุ (identification) เพื่อการวินิจฉัยโรค(disease diagnosis) และในการปฏิบัติต่างๆ ทางป้องกัน กำจัดโรค จึงมีความจำเป็นที่ต้องจำแนกโรคพืชออกเป็นหมู่ต่างๆ
การจำแนกแบ่งโดยอาศัยพื้นฐานต่างๆ เป็นหลักดังนี้
1. การจำแนกอาศัยอาการของพืชที่เป็นโรค
2. การจำแนกอาศัยส่วนของพืชที่เป็นโรค
3. การจำแนกอาศัยแบบของพืชที่เป็นโรค
4. การจำแนกอาศัยความเสียหายและแพร่ระบาดของโรค
5. การจำแนกอาศัยแบบของสาเหตุของพืชที่เป็นโรค
การจำแนกอาศัยอาการของพืชที่เป็นโรค (classification base on symptoms of plants affected)
โรคพืชจำแนกโดยการใช้อาการของโรคบนพืชเป็นหลัก เป็นชื่อสามัญทีใช้ทั่วไปและสะดวก เช่นโรครากเน่า โรคเมล็ดเน่า โรคใบจุด โรคเหี่ยว (wilts) โรคใบแห้ง (leaf blights) โรคแอนแทรคโนส โรคเขม่าดำ
โรคราสนิม โรค canker เป็นต้น การแบ่งดังกล่าวเป็นการซับซ้อนกันโดยชื่อโรคเดียวกันนั้น อาจเกิดจากจุลินทรีย์ได้หลายแบบและหลายชนิด ซึ่งแต่ละแบบและแต่ละชนิดของเชื้อนั้นก็มีคุณสมบัติแตกต่างกันอย่างมากมาย ทำให้ในแง่ของการใช้ประโยชน์ในทางปฏิบัติ เช่นการควบคุมโรคไม่ถูกต้องสมบูรณ์ได้
การจำแนกอาศัยส่วนของพืชที่เป็นโรค (classification base on plant parts affected)
โรคพืชจำแนกออกเป็นกลุ่มโดยการใช้ส่วนของพืชที่เป็นโรค ได้แก่ โรคที่ราก (root diseases) โรคทีลำต้น (stem diseases) โรคที่ใบ (foliage diseases) โรคที่ผล (fruit diseases) เป็นต้น การแบ่งดังกล่าวค่อนข้างจะซับซ้อนในรายละเอียด เพราะบางโรคสามารถทำให้เกิดโรคได้ทุกส่วนของพืชบางโรคเกิดเฉพาะส่วน เช่นรา Piricularia oryzae ทำให้เกิดโรคไหม้ที่ใบ เมล็ด ต้นกล้า กับข้าว เป็นต้น
เชื้อบางชนิดก็สามารถเจริญบนพืชได้หลายส่วน เช่นรา Penicillium spp. ทำให้เมล็ด ผล ของพืชหลายชนิดเน่า แต่ปกติไม่ได้ทำให้ส่วนอื่นของพืชเป็นโรค
การแบ่งดังกล่าวนี้ไม่เหมาะกับงานทางวิทยาศาสตร์ เพราะโครงสร้าง และสรีระวิทยาของพืชที่เป็นโรค ตลอดจนเชื้อที่เป็นสาเหตุของโรค ไม่มีส่วนที่แสดงออกให้ทราบด้วย
การจำแนกอาศัยแบบของพืชที่เป็นโรค (classfication base on types of plants
การจำแนกเป็นการแบ่งอย่างกว้างๆ โดยใช้แบบของพืชเป็นหลัก แทบจะไม่ได้ประโยชน์อะไรเลยทางวิทยาศาสตร์ ได้แก่โรคของพืชไร่ (field crops diseases) โรคของผัก (vegetable diseases) โรค ของไม้ผล (fruit tree diseases) โรคของป่าไม้ (forest diseases) โรคไม้ดอกไม้ประดับ (diseases of ornamental plants) โรคของสนามหญ้า (turf diseases) เป็นต้น
การจำแนกอาศัยความเสียหายและแพร่ระบาดของโรค (classification base on destructiveness and spreading)
การทำความเสียหายของโรคต่างชนิดกันจะมีความแตกต่างอย่างมากมายโรคบางชนิดจะทำลายพืชให้ตายอย่างรวดเร็ว โดยที่ไม่ทำความเสียหายแก่พืชอื่นเลย โรคที่ทำความเสียหายให้มากที่สุด นอกจากจะทำ ให้พืชตายหรือลดผลผลิตให้ต่ำลงแล้ว ยังจะต้องแพร่ระบาดจากต้นที่เป็นโรคไปยังต้นอื่น ท้องที่อื่นๆ และในภูมิภาคส่วนนั้นในที่สุด โรคที่ทำความเสียหายเป็นอันตรายในระดับดังกล่าวเรียกว่า epidemic diseases เช่น โรคใบไหม้ของมันฝรั่ง และโรคราสนิมบางชนิดของธัญญพืช ซึ่งเป็นผลทำให้พืชดังกล่าวมีผลผลิตน้อยลง ไม่เพียงพอต่อการบริโภคเกิดการขาดอาหารถึงตายได้ โรคที่ทำความเสียหายรุนแรงและแพร่ระบาดรวดเร็วเช่นนี้จึงมีความสำคัญอย่างยิ่งในการร่วมมือในชาติและระหว่างชาติในการป้องกันดังกล่าว การแบ่งแยกโรคในลักษณะนี้ทำให้สอดคล้องในการที่จะหยิบยกปัญหาเฉพาะโรคที่ทำความเสียหายรุนแรงเพื่อการศึกษาร่วมมือกันอย่างกว้างขวางระหว่างประเทศได้โดยสะดวก
การจำแนกอาศัยแบบของสาเหตุที่ทำให้พืชเป็นโรค (classification base on types of causal agents)
โรคพืชจะแบ่งออกเป็นกลุ่มโดยอาศัยแบบของเชื้อที่เป็นสาเหตุทำให้เกิดโรค ได้แก่โรคที่เกิดจากสิ่งที่มีชีวิต และโรคพืชที่เกิดจากสิ่งไม่มีชีวิต และสาเหตุใหญ่ดังกล่าวจะได้แบ่งออกเป็นกลุ่มย่อยตามตำแหน่ง ทางอนุกรมวิธานของเชื้อซึ่งไม่เกี่ยวกับธรรมชาติและลักษณะอาการของโรค แต่ก็มีเชื้อโรคบางแบบเป็นสาเหตุของโรคที่มีลักษณะอาการคล้ายกัน เช่นแบบเชื้อราที่ทำให้เกิดโรครานํ้าค้าง (downy mildews) โรคราแป้งขาว (powdery mildews)โรคเขม่าดำ โรคราสนิม โดยเชื้อที่เป็นสาเหตุในแต่ละโรคจะอยู่ในกลุ่มอนุกรมวิธานของเชื้อรานั้นโดยเฉพาะ ฉะนั้นเชื้อของโรคดังกล่าวจึงบอกถึงเชื้อราที่เป็นสาเหตุในกลุ่มเดียวกัน และลักษณะอาการของโรคที่เหมือนกันพร้อมกันไปด้วย
การวินิจฉัยโรคพืช (Diagnosis of plant diseases)
การวินิจฉัยโรคพืช เป็นการลงความเห็นถึงสาเหตุของโรค เพื่อจักได้ให้คำแนะนำ แก้ไขปัญหาต่างๆ ที่เกิดขึ้นในการเพาะปลูกพืช การวินิจฉัยมีอันดับขั้นตอน ดังนี้
ก. พิจารณาก่อนว่า โรคนั้นเป็นโรคติดเชื้อ หรือเป็นโรคที่ไม่ใช่โรคติดเชื้อ ปกติโรคที่เป็นโรคติดเชื้อ จะแสดงอาการของโรคที่มีสิ่งที่แสดงออกให้เห็นได้ของเชื้อที่เป็นสาเหตุ (signs) เช่น ส่วนใดส่วนหนึ่งของเชื้อ ได้แก่สปอร์ เส้นใย ส่วนขยายพันธุ์ เป็นต้น อยู่ด้วย ซึ่งสามารถตรวจเห็นได้ด้วยแว่นกำลังขยายตา( X 10,x15, x30) ยกเว้นโรคที่เกิดจากวิสาไวรอยด์ และมายโคพลาสมา ที่จะปรากฏเฉพาะอาการของโรค เหมือนกับโรคที่ไม่ใช่โรคติดเชื้อที่เกิดจากสภาพแวดล้อมไม่เหมาะสม
ข. หากไม่พบเชื้อที่เป็นสาเหตุบนหรือในส่วนของพืชที่เป็นโรค และอาการดังกล่าวไม่เหมือนกับอาการของโรคที่เกิดจากวิสาไวรอยด์และมายโคพลาสมา พร้อมทั้งพืชไม่มีรอยหรือแผลลักษณะใดๆ ให้ห็นว่ามีไส้เดือนฝอยเป็นปรสิตอยู่ภายนอกพืช (ectoparasite) และไม่มีร่องรอยของแมลง อาจวินิจฉัยได้ว่า โรคนั้นเป็นโรคที่เกิดจากสิ่งไม่มีชีวิต หรือสภาพแวดล้อมไม่เหมาะสม
ค. การวินิจฉัยโรคที่เกี่ยวกับสภาพแวดล้อมไม่เหมาะสม ให้ตรวจเกี่ยวกับลักษณะอาการของโรค ในเอกสารอ้างอิงที่ทราบอยู่แล้ว หากไม่ตรงกับโรคใดโรคหนึ่งที่มีอยู่ โรคที่นำมาวินิจฉัยนั้นอาจเกิดจากสาเหตุที่ไม่ปกตินัก เช่น เกิดจากอากาศเย็น นํ้าท่วม การปฏิบัติทางการเกษตร ความเป็นกรดด่างของดินตลอดจนสารพิษจากแร่ธาตุต่างๆ ในดิน
ง. ถ้าพบเชื้อที่เป็นสาเหตุบนหรือในส่วนของพืชที่เป็นโรค จะจัดหมวดหมู่เชื้อนั้นโดยตรวจเทียบกับเชื้อในหนังสือเอกสารอ้างอิงที่รวบรวมไว้แล้ว โดยเฉพาะเกี่ยวกับโรคพืช และเชื้อที่เป็นสาเหตุหากพบชื่อเซื้อที่เป็นสาเหตุ มีคุณสมบัติต่างๆ ตรงกับเชื้อโรคที่นำมาตรวจแล้ว การจัดหมวดหมู่เชื้อนั้นก็จะเสร็จสมบูรณ์
จ. อย่างไรก็ตามหากเชื้อที่พบนั้น ไม่มีรายงานมาก่อนในการที่ทำให้เกิดโรคกับพืชที่นำมาตรวจในลักษณะดังกล่าวแล้ว เชื้อนั้นจะต้องนำมาตรวจพิสูจน์ว่าเป็นเชื้อสาเหตุของโรคจริงหรือไม่ต่อไปให้ครบตามวิธีของ Koch (Koch’s postulates) ซึ่งมีดังนี้
1. ส่วนของพืชที่แสดงอาการของโรคและเกิดจากจุลินทรีย์ จะต้องพบจุลินทรีย์ที่เป็นสาเหตุร่วมอยู่ในส่วนนั้นเสมอ (constant association)
2. เชื้อที่เป็นสาเหตุของโรคสามารถแยกนำไปเลี้ยงให้บริสุทธิ์ (isolation in pure culture) ในอาหารเลี้ยงเชื้อ หรือบนพืชปกติพันธุ์ที่เป็นโรคง่าย ในกรณีที่เชื้อโรคเป็นปรสิตแบบถาวร (obligate parasite)
3. นำเชื้อสาเหตุที่บริสุทธิ์นั้นไปปลูกบนพืชปกติที่เป็นชนิดและพันธุ์เดียวกับข้อ 2 ต้นพืชปกติจะต้องแสดงอาการของโรคให้เห็น
4. เชื้อที่เป็นสาเหตุสามารถแยกให้เป็นเชื้อบริสุทธิ์จากต้นพืชที่เป็นโรค จากผลการปฏิบัติในข้อ 3 ได้อีก แล้วนำไปปลูกบนต้นปกติใหม่ ต้นพืชปกตินั้นจะแสดงอาการของโรคให้เห็นอีกเหมือนในข้อ 3 (re – isolation and re – inoculation)
หากเป็นจริงตามวิธีการดังกล่าวแล้ว เชื้อที่แยกได้นั้นจึงจะเป็นเชื้อที่เป็นสาเหตุของโรค ในกรณีที่พืชเป็นโรคเกิดจากวิสา ไวรอยด์ มายโคพลาสมา ริคเคทเชีย และโปรโตซัว การพิสูจน์โรคตามวิธีดังกล่าว อาจมีการแตกต่างไปบ้างในรายละเอียด เนื่องจากธรรมชาติของโรคและคุณสมบัติของเชื้อที่เป็นสาเหตุแตกต่างไปจากโรคและเชื้อที่เป็นสาเหตุอื่นๆ
การวินิจฉัยโรคติดเชื้อ
โรคติดต่อเชื้อมักมีเชื้อที่เป็นสาเหตุของโรคเจริญอยู่บนผิว หรือภายในของพืชอาศัย โดยเชื้อสาเหตุโรคส่วนมากจะเจริญอยู่ภายในของพืช เชื้อสาเหตุโรคที่พบเจริญบนผิวพืช ได้แก่ เชื้อรา บักเตรี พืชชั้นสูงที่เป็นปรสิต และไส้เดือนฝอยศัตรูพืช เช่น ราสาเหตุโรคราแป้งขาว (powdery mildews) ฝอยทอง ไส้เดือนฝอย เป็นต้น การตรวจสอบและการจัดหมู่เชื้อสาเหตุของโรคที่มีเชื้อเจริญบนผิวพืช สามารถทำได้โดยอาศัยความชำนาญจากการตรวจด้วยตาเปล่า หรือใช้แว่นกำลังขยายตํ่าช่วย ในบางกรณีอาจต้องตรวจด้วยกล้องจุลทัศน์ เพื่อดูลักษณะของepidemic เซลของบักเตรีและไส้เดือนฝอย การวินิจฉัยดังกล่าวนั้นอาจจะเป็นต้องใช้อาการของโรคประกอบด้วย โดยเฉพาะพืชที่เป็นโรคที่มีเชื้อสาเหตุของโรคอยู่ภายในพืช ปกติเชื้อจะอยู่ที่บริเวณขอบของเนื้อเยื่อที่ถูก ทำลาย ที่ท่อนํ้าท่ออาหาร โคนต้น และรากพืช
โรคเกิดจากเชื้อรา
ราจะต้องผ่านการตรวจลักษณะทางสัณฐานของเส้นใย fruiting bodies สปอร์ ด้วยกล้องจุลทัศน์ โดยเทียบกับหนังสือ เอกสารอ้างอิงต่างๆ ทางราวิทยา (mycology)และโรคพืชวิทยาที่มีรายงานเชื้อสาเหตุ ของโรคพืชนั้นไว้ หากอาการของโรคและเชื้อที่ตรวจ มีลักษณะตรงตามในเอกสารอ้างอิง การวินิจฉัยก็เป็นอันสิ้นสุด ถ้าเชื้อมีลักษณะที่แตกต่างออกไป ก็แสดงว่าเชื้อนั้นเป็นรา saprophyte ซึ่งเจริญบนเนื้อเยื่อพืช ที่ตาย ภายหลังที่เชื้อสาเหตุโรคทำลายแล้ว หรืออาจเป็นเชื้อที่เพิ่งพบ ไม่มีรายงานมาก่อน หรือลักษณะเชื้อ เพียงแต่คล้าย ชวนให้สงสัย การพิสูจน์ก็จะต้องดำเนินต่อไป ตามวิธีการของ Koch ดังได้กล่าวไว้แล้ว
ในบางกรณีมักพบบ่อยๆ ที่เชื้อที่ตรวจนั้นไม่มี fruiting bodies และ/หรือ สปอร์ให้เห็นทำให้ไม่สามารถจัดหมวดหมู่เชื้อนั้นได้ ก็จะต้องนำตัวอย่างโรคนั้นไปเก็บไว้ในตู้ชื้น (moist chamber) หรืออาจใช้ภาชนะ เช่น กล่อง และถุงพลาสติค ที่มีผ้าหรือกระดาษทิชชู ชุ่มน้ำวางรองรับอยู่ แทนก็ได้ ซึ่งเป็นการเพิ่มความชื้นให้แก่อากาศในภาชนะ เชื้อจะเจริญสร้างสปอร์และ/หรือ fruiting bodies ภายใน 72 ชั่วโมง
โรคเกิดจากบักเตรี
การวินิจฉัยโรคและจัดหมวดหมู่เชื้อบักเตรีสาเหตุโรค อาศัยลักษณะอาการของโรคเป็นพื้นฐานอันดับแรก และจำนวนเซลของบักเตรีจากบริเวณเนื้อเยื่อของตัวอย่างพืชที่เป็นโรค มีปริมาณมาก และสม่ำเสมอ โดยอาศัยจากการทำสไลด์ตรวจภายใต้กล้องจุลทัศน์หลายครั้ง เพราะบักเตรีมีขนาดเล็กมาก (0.8 X 1-2 ไมครอน) เป็นท่อนเล็กๆ ไม่สามารถแยกความแตกต่างโดยอาศัยลักษณะสัณฐานของเชื้อ ในการจัดหมวดหมู่ได้ ทำให้ไม่ทราบว่าเชื้ออะไรเป็นสาเหตุของโรคหรือเป็นบักเตรีแชบโปรไฟต์จากเนื้อเยื่อที่ตายเพราะเชื้อสาเหตุโรค หรือเพราะสาเหตุอื่นมาก่อน อย่างไรก็ตามเราสามารถตรวจสอบได้แน่นอนและไม่ยากนัก โดยวิธีแยกเชื้อให้บริสุทธิ์ในอาหารเลี้ยงเชื้อ แล้วนำเชื้อไปปลูก (inoculation) กับพืชพันธุ์ที่เป็นโรคง่าย (susceptible host) เพื่อดูอาการของโรคที่เกิดขึ้น โดยเปรียบเทียบกับอาการของโรคบนพืชชนิดเดียวกัน และเกิดจากบักเตรีที่ทราบชื่อชนิดของเชื้อแล้ว หากมีอาการเหมือนกันก็แสดงว่าเกิดจากเชื้อสาเหตุชนิดเดียวกัน
โรคเกิดจากวิสา ไวรอยด์ มายโคพลาสมา ริคเคทเซีย และโปรโตซัว
การวินิจฉัยโรคค่อนข้างยุ่งยากมากกว่าโรคที่กล่าวมาแล้วข้างต้น เนื่องจากสาเหตุที่สำคัญ 2 ประการ คือ
1) เชื้อสาเหตุมีขนาดเล็ก โปร่งแสง และมีจำนวนน้อยจากตัวอย่างที่นำมาตรวจ เนื่องจากเชื้ออยู่กระจายทั่วไปในพืชที่เป็นโรค เชื้อส่วนมากไม่สามารถเห็นได้ด้วยกล้องจุลทัศน์ธรรมดา ต้องตรวจสอบด้วยกล้อง จุลทัศน์อีเลคตรอน ซึ่งบางครั้งก็อาจตรวจไม่พบได้เช่นกัน
2) อาการโรคไม่มีลักษณะเฉพาะ เชื้อสาเหตุโรคดังกล่าวมีลักษณะอาการโรคคล้ายๆ กัน และยังคล้ายกับอาการโรคที่เกิดจากสาเหตุอื่นๆ อีก เช่น โรคเกิดจากสภาพแวดล้อมไม่เหมาะสม โรคเกิดจากเชื้ออื่นๆ ที่ทำลายระบบรากและพืชที่ได้รับความเสียหายจากแมลง
การวินิจฉัยโรคเกิดจากวิสา ไวรอยด์ มายโคพลาสมา (MLO) ริคเคทเซีย (RLO) และโปรโตซัว นั้น ควรดำเนินตามขั้นตอนดังนี้
1. ทำการพิสูจน์ว่าพืชที่เป็นโรคมีสาเหตุมาจากเชื้อดังกล่าว ไม่ใช่เป็นโรคเกิดจากสาเหตุอื่นๆ โดยการปลูกเชื้อลงในต้นปกติที่เป็นพืชชนิดเดียวกันด้วยวิธีถ่ายทอดเชื้อ (transmitting) จากต้นที่เป็นโรคด้วย วิธีการที่ปฏิบัติกันทั่วไปเช่นการติดตา (budding) และการทาบกิ่ง (grafting) จากพืซที่เป็นโรคไปยังพืชปกติ การใช้นํ้าคั้นจากต้นที่เป็นโรคไปถูบนต้นปกติ (rubbing) การใช้แมลง และไส้เดือนฝอย หรือพาหนะอื่น ปล่อยกินพืชที่เป็นโรคระยะหนึ่ง แล้วย้ายให้ไปกินบนพืชปกติ เพื่อให้เชื้อถ่ายทอดสู่พืช หากพืชปกติเกิดโรค แแสดงว่าพืชที่เป็นโรคนั้นเป็นโรคเกิดจากเชื้อ ไม่ใช่มีสาเหตุมาจากสภาพแวดล้อมไม่เหมาะสม
2. พิจารณาจากคุณสมบัติการถ่ายทอดเชื้อ โดยอาศัยการค้นคว้าวิจัยเท่าที่ทราบกันอยู่ในปัจจุบันว่า โรคที่เกิดจากมายโคพลาสมา ริคเคทเซีย และโปรโตซัว สามารถถ่ายทอดได้เพียงการติดตา ทาบกิ่ง และแมลงพาหนะบางชนิด ส่วนโรคที่เกิดจากวิสา และไวรอยด์ จะถ่ายทอดเชื้อได้ด้วยน้ำคั้น ไส้เดือนฝอย และวิธีอื่นเฉพาะโรค
วิธีทดลอบเพื่อแยกโรคว่าจะมีวิสา ไวรอยด์ มายโคพลาสมา ริคเคทเซียหรือโปโตซัว เชื้อใดเชื้อหนึ่ง เป็นสาเหตุนั้น ทำได้เป็นขั้นตอน ดังนี้คือ
1) ปลูกเชื้อบนพืชอาศัยต่างๆ แล้วเปรียบเทียบอาการของโรคที่เกิดขึ้นกับพืชอาศัยชนิดเดียวกันที่เป็นโรคและทราบเชื้อสาเหตุของโรคแน่นอนแล้ว
2)  ตรวจเนื้อเยื่อที่เป็นโรค ด้วยกล้องจุลทัศน์อีเลคตรอน เพื่อเปรียบเทียบลักษณะสัณฐานของเชื้อ
3) การใช้ปฏิชีวนะสาร เตตราไซคลิน (tetracyclines) และเพนนิซิลิน ทดสอบ โดยฉีดพ่นแยกกัน หากพืชที่เป็นโรค ฉีดพ่นด้วยเตตตราไซคลิน หายหรืออาการดีขึ้น แสดงว่าพืชนั้นเป็นโรคเกิดจากมายโคพลาสมา แต่ถ้าพืชฉีดพ่นด้วยเพนนิซิลินหายหรืออาการดีขึ้น แสดงว่าพืชเป็นโรคเกิดจากกริคเคทเซีย
4) การใช้พืชที่เป็นโรคแช่นํ้าร้อน หรือไอร้อนผ่าน โดยกำหนดให้มีอุณหภูมิและระยะเวลาต่างๆ กัน พืชที่เป็นโรคเกิดจากมายโคพลาสมาหรือริคเคทซีย จะหายหรือมีอาการดีขึ้น ในอุณหภูมิที่ตํ่าและใช้เวลาระยะสั้นกว่าพืชที่เป็นโรคเกิดจากสาขา และ
5) การใช้วิธีการทางเซรุ่มวิทยาตรวจสอบ โดยการใช้ antiserum ของเชื้อที่ทราบสาเหตุของโรคแล้วทดสอบ โดยหยดผสมกับน้ำคั้นพืชที่เป็นโรคและต้องการทราบเชื้อสาเหตุ หากมีปฏิกิริยาเกิดขึ้นก็แสดงว่าเป็นเชื้อเดียวกับที่ใช้ผลิตแอนตี้เซรุ่มนั้น วิธีการนี้สามารถทราบและจัดหมวดหมู่เชื้อได้เร็ว
โรคเกิดจากไส้เดือนฝอย
ไส้เดือนฝอยสาเหตุโรคจะอยู่ที่ผิว หรือภายในของพืชที่เป็นโรค โดยไส้เดือนฝอยศัตรูพืชแตกต่างไปจากไส้เดือนฝอยชนิดอื่นๆ ที่อยู่อย่างอิสระ ที่มีหลอดดูดอาหาร (stylet or spear) ไส้เดือนฝอยนอกจากเป็นปรสิตโดยตรงแล้ว ยังเป็นพาหะนำโรคและสามารถส่งเสริมให้อาการของโรคเพิ่มพูนขึ้น การวินิจฉัยก็โดยอาศัย เปรียบเทียบอาการของโรคพืชกับโรคที่ทราบอยู่แล้วว่าเป็นไส้เดือนฝอยชนิดและสกุลใดเป็นสาเหตุอยู่
โรคเกิดจากพืชชั้นสูงที่เป็นปรสิต
การวินิจฉัยโรคสามารถเห็นได้โดยง่าย เช่นฝอยทองที่ขึ้นเป็นเส้นพันกันบนพืช ต้นกาฝากบนพืชหญ้าจิ๋ว และ broomrape ซึ่งเป็นปรสิตที่รากจะเจริญโผล่บริเวณโคนต้นพืช เป็นต้น
การวินิจฉัยโรคเกิดจากบักเตรี และโรคเกิดจากเชื้อรา สามารถจะใช้วิธีการทางเซรุ่มวิทยาได้เช่นเดียวกัน หากผลิต antiserum ของเชื้อนั้นได้ การตรวจสอบที่ใช้เซรุ่มวิทยาในการวินิจฉัยโรคเกิดจากบักเตรี และเชื้อราได้ผลดีเช่นโรคขอบใบแห้งของข้าวเกิดจาก Xanthomonas oryzae และโรคแอนแทรคโนสของพริกเกิดจาก Colletotrichum capsici ตามลำดับ เป็นต้น
การเตรียมวัสดุอุปกรณ์ในการแยกเชื้อ
การแยกเชื้อราหรือบักเตรี สาเหตุโรคออกจากพืชที่เป็นโรค มีความจำเป็นต้องเตรียมวัสดุอุปกรณ์ ที่เป็นเครื่องมือและเครื่องใช้ดังต่อไปนี้
1. การฆ่าเชื้อของใช้ที่เป็นเครื่องแก้ว เช่น จานเลี้ยงเชื้อ (petri dishes) หลอดทดลอง (test tube) ปิเปตต์ (pipettes) โดยใช้ความร้อนแห้ง ด้วยทารอบในตู้ร้อน (hot air oven) อุณหภูมิ 150 – 160°ซ. เป็นเวลา 1 – 2 ชม. หรือนึ่งในหม้ออบไอน้ำ (autoclave) อุณหภูมิ 121°ซ. ซึ่งเท่ากับความดันไอ 15 ปอนด์ ต่อตารางนิ้ว เป็นเวลา 15-20 นาที โดยการห่อวัตถุดังกล่าวด้วย aluminum foil หรือกระดาษให้มิดชิดก่อนหรือแช่ในสารละลาย potassium dichromate ในกรดกำมะถันจนอิ่มตัวหรือเอธิลแอลกอฮอล์ 95% หรือ ในฟอร์มาลิน 5 % เป็นเวลาไม่น้อยกว่า 1 นาที การฆ่าเชื้อด้วยการแช่ในสารละลายดังกล่าว จะต้องผ่านการล้างด้วยนํ้าที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้วอีกครั้งหนึ่ง เพื่อชะล้างสารฆ่าเชื้อที่ติดมากับเครื่องแก้วให้หมดไป
2. การเตรียมนํ้ายาสำหรับฆ่าเชื้อที่ติดมากับผิวภายนอกชิ้นส่วนของเนื้อเยื่อพืชที่เป็นโรค น้ำยาเหล่านี้สำหรับใช้ในการจุ่มหรือแช่ ชิ้นส่วนพืช หรือเช็ดโต๊ะปฏิบัติการที่ใช้แยกเชื้อ น้ำยาดังกล่าวได้แก่ sodium hypochlorite เข้มข้น 5.75 % (clorox ผสมนํ้าสัดส่วน 1 : 9) ซึ่งใช้เวลาประมาณ 2 – 5 นาที แล้วแต่ขนาดชนิดของพืช หรือใช้ mercuric chloride เข้มข้น 1 : 1,000 ในน้ำ หรือ Rada’s solution (mercuric Dride 1 : 1,000 ในเอธิลแอลกอฮอล์ 50 %) ภายหลังการจุ่มหรือแช่ชิ้นส่วนพืช เพื่อฆ่าเชื้อในนํ้ายา ชิ้นส่วนที่ใช้จุ่ม/แช่ในน้ำยา clorox อาจใช้ดูดซับเอาน้ำยาออกได้ด้วยกระดาษทิชชูที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว แทนการล้างด้วยนํ้า
3. การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ อาหารเลี้ยงเชื้อรา หรือบักเตรีในห้องปฏิบัติการ มีส่วนประกอบแตกต่างกันไปตามจุดประสงค์ของการใช้อาหาร อาจเป็น synthetic media ซึ่งสามารถทราบส่วนประกอบทางเคมีของอาหารที่ใช้ทั้งหมด หรืออาจเป็น non – synthetic melin ซึ่งประกอบด้วยอินทรีย์สารที่เป็นโมเลกุลอย่างง่าย หรือซับซ้อนกัน และอาหารนั้นอาจอยู่ในรูปของอาหารแข็ง (solid media) โดยมีวุ้น (agar) เป็นส่วนผสมทำให้แข็ง หรืออาหารเหลว (liquid media) และอาหารกึ่งแข็ง (semisolid media) ที่เหมาะกับการเลี้ยงบักเตรีหรือราบางชนิดในระยะแรกของการเจริญของเชื้อ ซึ่งมีส่วนผสมของวุ้น และ gelatin ใน ปริมาณเท่ากัน อาหารที่ใช้เลี้ยงเชื้อโดยทั่วไปมีสารประกอบของคาร์บอนด์ เช่นนํ้าตาลประมาณ 1% สารประกอบไนโตรเยน ประมาณไม่เกิน 0.5 % และแร่ธาตุอื่นๆ ในรูปของเกลือต่างๆ เช่น ฟอสเฟต กำมะถัน โปแตสเซียม แมกนีเซียม และสารที่ต้องการอีกเพียงเล็กน้อย เช่น แคลเซียม เหล็ก สังกะสี แมงกานีส และโมลิบดีนัม
อาหารเลี้ยงที่ใช้เลี้ยงเชื้อราโดยทั่วไปได้มากที่สุด คือ PDA (potato dextrose agar) และอาหารที่เหมาะกับการใช้แยกเชื้อราจากบักเตรีที่เจริญปะปนอยู่ด้วย ได้แก่ water agar หรือ glucose agar (1 – 3 % glucose ใน water agar) หรืออาจใช้ lactic acid เข้มข้น 25 % ประมาณ 1 – 2 หยด ผสมในจานเลี้ยงเชื้อ ที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อ 10 ลบ. ซม. ขณะเทอาหารลงในจานเลี้ยงเชื้อ โดยกรดสามารถช่วยยับยั้งการเจริญของเชื้อบักเตรี
อาหารที่เหมาะกับการเลี้ยงและแยกเชื้อบักเตรีทั่วไป เป็น NA (nutrient agar) ซึ่งประกอบ peptone และ beef extract โดยมีวุ้นทำให้อาหารแข็งตัว
บักเตรีนับว่าเป็นจุลินทรีย์พวกเดียวที่เป็นสาเหตุโรคพืช สามารถเจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อได้ทั้งหมด ส่วนเชื้อราไม่สามารถนำมาเลี้ยงได้ทุกชนิด เช่นราสาเหตุโรคราแป้งขาว (order Erysiphales) ราน้ำค้าง (order Peronosporales) และราสนิม (order Uredinales) แต่สำหรับราสนิมบางชนิด บางระยะของการเจริญเติบโตของเชื้อ อาจสามารถนำไปเลี้ยงในอาหารที่มีส่วนประกอบพิเศษเพิ่มเติมอีกได้

ภาพแสดงการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแข็ง ในจานและในหลอดเลี้ยงเชื้(ที่มา:Agrios, 1978)
การแยกเชื้อสาเหตุโรค
การแยกเชื้อจากใบ และส่วนของพืชที่อยู่กับดิน
ใบพืชที่เป็นโรค อาจแสดงอาการจุด หรือใบไหม้ ราก หัว และส่วนของพืชที่อยู่กับดิน เนื้อเยื่อของพืชที่เป็นโรคสัมผัสกับอากาศดินและสิ่งอื่นที่อยู่โดยรอบ ทำให้มีเชื้อจุลินทรีย์อื่นๆ ติดปะปนอยู่ตามผิวนอกของส่วนที่เป็นโรค การแยกเชื้อทำโดยตัดชิ้นส่วนที่เป็นโรคเป็นชิ้นเล็กๆ ขนาดเนื้อที่ประมาณ 5-10 ตาราง ม.ม. ตรงบริเวณคาบต่อระหว่างเนื้อเยื่อที่เป็นโรคกับเนื้อเยื่อดี แล้วนำไปจุ่มแช่น้ำยาฆ่าเชื้อโรค (10 % clorox) ก่อนนำไปเลี้ยงเชื้อต่อไป เพื่อทำลายเชื้อจุลินทรีย์อื่นๆ ที่ติดปะปนอยู่ตามผิวนอกของชิ้นส่วนพืช แต่สำหรับส่วนของพืชที่อยู่ติดดิน เช่น ราก หัว ก็ควรล้างเอาดินที่ติดมาด้วยออกเสียก่อน หากเนื้อเยื่อที่เป็นโรคอยู่ภายในไม่มีโอกาสปะปนกับจุลินทรีย์ภายนอกอื่นๆ อาจฉีกออกแล้วตัดนำไปเลี้ยงเชื้อโดยไม่ต้องผ่านการจุ่มฆ่าเชื้อก่อนได้ มีด กรรไกร และปากคีบ ที่ใช้ปฏิบัติการ ต้องผ่านการลนไฟฆ่าเชื้อก่อนทุกครั้ง
การแยกเชื้อจากส่วนอื่นๆ บนต้น
การแยกเชื้อปฏิบัติเช่นเดียวกับการแยกเชื้อจากใบ และส่วนของพืชที่อยู่กับดิน ดังได้กล่าวไว้แล้วแต่ไม่ต้องล้างพืชก่อนนำไปตัด หรือฉีดออกให้ได้ชื้นส่วนที่มีคาบต่อระหว่างเนื้อเยื่อดีกับเนื้อเยื่อที่เป็นโรค แล้วจึงนำไปเลี้ยงเชื้อต่อไป
เมื่อได้ชิ้นส่วนของเนื้อเยื่อพืชที่เป็นโรค ซึ่งได้ผ่านการฆ่าเชื้ออื่นๆ ที่อาจปะปนมาตามผิวนอก หรือเป็นชิ้นส่วนที่เข้าใจว่ามีเฉพาะเชื้อสาเหตุโรค ไม่มีเชื้ออื่นๆ ปะปนแล้ว ก็นำชิ้นส่วนนั้นไปแยกเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยใช้อาหารให้เหมาะสมกับจุลินทรีย์สาเหตุโรค เช่น เชื้อรา ใช้ PDA และบักเตรี ใช้ NA เป็นต้น ส่วนวิธีการที่ใช้กัน มีอยู่ 3 วิธี คือ
1. Dilution plate method โดยนำชิ้นส่วนนั้นไปขยี้ในหลอดนํ้ากลั่นที่ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อและทิ้งไว้ให้เย็นแล้วด้วยแท่งแก้ว แล้วแบ่งถ่ายด้วยปิเปตต์ ไปยังหลอดน้ำกลั่นหลอดอื่น เพื่อทำให้เชื้อเจือจางลง เขย่าให้เข้ากัน การทำให้เจือจางสามารถเพิ่มจำนวนได้ตามความเหมาะสม แล้วแบ่งถ่ายแต่ละหลอดด้วยปิเปตต์ ประมาณ 0.5 ลบ.ซม. ไปผสมกับอาหารPDA หรือ NA ที่หลอมเหลว และทิ้งไว้จนอุ่นอุณหภูมิประมาณ 45- 50° ซ. ในจานเลี้ยงเชื้อ เอียงจานเลี้ยงเชื้อไป – มา จนผสมเข้ากัน ปล่อยให้แข็งเก็บในตู้เลี้ยงเชื้อต่อไป วิธีนี้เหมาะสำหรับแยกบักเตรีสาเหตุโรค แท่งแก้วและปิเปตต์ต้องผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว
2. Streak plate method ใช้ loop ที่ลนไฟฆ่าเชื้อแล้ว จิ้มที่คาบต่อระหว่างเนื้อเยื่อดีกับเนื้อเยื่อที่เป็นโรค นำ loop ไปทำ cross streak plate บนอาหาร PDA หรือ NA ในจานเลี้ยงเชื้อ วิธีนี้เหมาะสำหรับแยกบักเตรีสาเหตุโรคอาการเน่าเละ
3. Tissue transplanting method นำชิ้นส่วนนั้นไปวางบนอาหารPDA หรือ NA ในจานเลี้ยงเชื้อด้วยปากคีบที่ลนไฟฆ่าเชื้อแล้ว ประมาณจานละ 4 – 5 ชิ้น วิธีนี้เหมาะสำหรับแยกเชื้อรา
การเลี้ยงเชื้อต้องใช้เวลาประมาณ 1 – 5 วัน หาทเชื้อที่ได้เป็นโคโลนีที่ไม่บริสุทธิ์ ถ้าเป็นเชื้อบักเตรีจำเป็นต้องปฏิบัติตามวิธีที่ 1 หรือ 2 ซ้ำอีก สำหรับเชื้อราควรใช้วิธี single spore isolation หรือ hyphal tip isolation เมื่อได้โคโลนีบริสุทธิ์ จึงย้ายไปเลี้ยงในหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อต่อไป

ภาพการแยกเชื้อราจากพืชที่เป็นโรค (ที่มา:Agrios, 1978)
ที่มา:ไพโรจน์  จ๋วงพานิช