(Purification of plant viruses)
การแยกและทำวิสาให้บริสุทธิ์ มีจุดมุ่งหมายเพื่อแยก nucleoprotein ของวิสา ออกจากส่วนประกอบต่างๆ ของเซลพืชอาศัย โดยวิสายังคงสภาพและมีคุณสมบัติครบถ้วนในสารละลายที่เข้มข้น วิธีการมีขั้นตอนตามลำดับดังนี้
1. การแยกวิสาออกจากส่วนประกอบของพืช (extraction) โดยบดเนื้อเยื่อพืชที่เป็นโรคในโกร่ง (mortar) หรือใช้เครื่องปั่น (blender) แล้วกรองด้วยผ้าขาวบาง เพื่อเอาส่วนประกอบขนาดใหญ่และชิ้นส่วนของพืชออก
ตัวอย่างพืชที่เย็นจัดก่อนบดหรือปั่น อาจช่วยให้แยกวิสาออกมาจากพืชได้มากขึ้น และการใช้น้ำคั้นที่เป็น buffer ปกติใช้ 0.02-0.5 M phosphate, pH 7.3 หรือสาร reducing agents ต่างๆ เช่น ascorbic acid, cysteine hydrochloride, sodium sulfite, sodium thioglycollate เพื่อป้องกันวิสารวมตัวกับสารประกอบฟีนอลต่างๆ จากพืช ช่วยให้วิสาคงสภาพ คุณสมบัติไม่เสี๋อม
การแยกส่วนประกอบต่างๆ ของเซล เช่น ribosomes, nuclei, chloroplasts โปรตีน รงควัตถุ ออกเพื่อให้เหลือเฉพาะ nucleoprotein ของวิสาในสารละลาย ทำโดยการให้ความร้อน หรือการแช่แข็ง เพื่อให้โปรตีนพืชตกตะกอน หรือการใช้สารละลายอินทรีย์ เช่น butanal, chloroform, ethanal, acetone etc. หรือกรอง โดยเติม celite, bentonite, charcoal etc. เพื่อช่วยดูดซับ ส่วนประกอบต่างๆ ของพืชก่อนกรอง หรือโดยการหมุนเหวี่ยงสารละลายด้วยความเร็วตํ่า (low speed centrifuge) อัตรา 5,000-10,000 g. (rpm, round per minute) เป็นเวลาประมาณ 10-20 นาที ซึ่งทำให้ได้วิสาอยู่ที่ส่วนบนของสารละลาย
2. การเพิ่มความเข้มข้นและทำให้วิสาบริสุทธิ์ขึ้น (concentration)
เป็นการเพิ่มความเข้มข้นของวิสาและแยกสารปะปนที่มีนํ้าหนักโมเลกุลตํ่าออกทำได้ 2 วิธี คือ
วิธีของฟิสิกส์ สามารถใช้ได้ผลดี วิสาคงสภาพไม่สูญเสียความสามารถในการทำให้เกิดโรคดีกว่าวิธีทางเคมี มีดังนี้
ก. การหมุนเหวี่ยงด้วยความเร็วสูง (high-speed sedimentation) เพื่อทำให้วิสาถูกเหวี่องไปอยู่ที่ก้นหลอด วิสายังคงสภาพอยู่เหมือนเดิม ทำให้แยกวิสาออกจากสิ่งปะปนที่มีนํ้าหนักโมเลกุลต่ำกว่าได้ แล้วนำวิสา (pellet) นั้นกลับไปละลายในสารละลาย buffer เพื่อให้คงสภาพ
ข. Density gradient centrifugation เป็นการหมุนเหวี่ยงด้วยความเร็วสูง (ultracentrifuge) โดยทำสารละลาย sucrose ใส่ในหลอดที่ใช้วางในโรเตอร์ให้เป็นชั้น แต่ละชั้นมีความเข้มข้นต่างๆ กันและหนาประมาณ 2 ซม. ชั้นที่อยู่บนมีความเข้มข้นน้อยกว่าชั้นล่างเรียงตามลำดับ ส่วนที่เหลือของหลอดบนสุด จะใส่สารละลายของวิสาที่ต้องการแยก ใช้ความเร็วประมาณ 20,000-150,000 g. ทำให้วิสาถูกเหวี่ยงไปอยู่ที่คาบต่อระหว่างชั้นของ sucrose ต่างๆ แล้วแต่ขนาดรูปร่าง และความหนาแน่นของวิสา ในตำแหน่งที่คาบต่อของชั้นที่มีความหนาแน่นของ sucrose เท่าวิสา เป็นแถบให้เห็นเก็บวิสาได้โดยใช้เข็มฉีดยาแทงผ่านทางก้นหลอดดูดออก ใส่หลอดทดสอบไว้แยกกัน
ค. Isoelectric precipitation วิสาตกตะกอนที่บริเวณ isoelectric point ซึ่งเป็นคุณสมบัติของโปรตีนที่มีการละลายต่ำ ตะกอนแยกออกได้ด้วยการหมุนเหวี่ยง หรือการกรอง เหมาะสำหรับใช้แยกวิสาที่สามารถคงสภาพได้ด้วยวิธีนี้

ภาพขั้นตอนการเตรียมวิสาสาเหตุโรคให้บริสุทธิ์ (ที่มา : Agrios, 1978)
ง. Gel filtration กรองโดยใช้ column ของ Sephadex, agar หรือ agarose แยกโมเลกุลที่มีขนาดเล็กกว่าออกจากสารละลายของวิสา ด้วยการใส่สารละลายที่ต้องการแยกบน column อนุภาควิสา ไหลผ่าน column ในอัตราที่เร็วกว่าส่วนประกอบอื่นๆ ของเซล ที่มีนํ้าหนักโมเลกุลตํ่ากว่า โดยอนุภาควิสา สามารถเข้าไปในช่องว่างของ gel ได้
จ. Dialysis แยกโดยส่วนประกอบของเนื้อเยื่อพืชในสารละลายที่มีนํ้าหนักโมเลกุลต่ำกว่าวิสา ไหลผ่าน cellulose membrane โดยการเปลี่ยน medium บ่อยๆ วิธีนื้ช้ากว่า gel filtration และปกติใช้ภายหลังวิธีการตกตะกอน หรือตกผลึกด้วยเกลือ และวิธี density gradient fractionation ในสารละลายเกลือ หรือ sucrose
วิธีทางเคมี เป็นวิธีการเติมเกลือ ปกติใช้ ammonium sulfate หรือโดยตกตะกอนด้วยแอลกอฮอล์ acetone แล้วนำไปหมุนเหวี่ยง เพื่อแยกเอาวิสาออก ไปละลายใน buffer ที่เหมาะสมไว้ใช้ต่อไป
การแยกและทำให้วิสาบริสุทธิ์ ดังกล่าวนั้น อาจยังมีสารที่มีนํ้าหนักโมเลกุลต่ำ หรือสูง ของส่วนประกอบของพืชปะปนอยู่ การทำให้วิสาบริสุทธิ์ต่อไป สามารถทำได้อีก แต่ทั้งนี้ย่อมขึ้นอยู่กับจุดประสงค์ ของการเตรียม และความคงสภาพของวิสา โดยอาจปฏิบัติซํ้า ตามวิธีการที่กล่าวแล้ว ไม่ต่ำกว่า 2 วิธี เช่น การตกตะกอนด้วยเกลือ ammonium sulfate หรือการหมุนเหวี่ยงด้วยความเร็วสูงและต่ำสลับกันหลายครั้ง เป็นต้น แต่วิธีการที่ให้ประโยชน์และใช้ทั่วไปมากที่สุดได้แก่ density gradient centrifugation ส่วนวิธีการอื่นๆ มี density gredient electrophoresis, gel electrophoresis, agar gel filtration and chromatography
คุณสมบัติทางเซรุ่มวิทยา (Serological properties)
เมื่อฉีดสารโปรตีนเข้าไปในสัตว์ การตอบโต้ต่อสิ่งแปลกปลอมที่เข้าไปนั้นจะเกิดขึ้นในสายเลือดของสัตว์โดยมี antibodies ซึ่งเป็นโปรตีนที่ถูกเปลี่ยนแปลงไปและมีคุณสมบัติเฉพาะเกิดขึ้น สารแปลกปลอมที่ฉีดเข้าไปแล้วไปกระตุ้นให้เกิด antibody ได้นั้น เรียกว่า antigen โดยทั่วไป antigen จะเป็นโปรตีนที่มีอยู่ในธรรมชาติ และสารพวก lipid คาร์โบไฮเดรทและ polysaccharide ก็สามารถทำให้มีการสร้าง antibody ได้ แต่ส่วนใหญ่ antigen จะประกอบด้วยสารโปรตีนสูง เซรุ่ม (serum) ที่มี antibody อยู่ด้วย เรียกว่า antiserum โดยเซรุ่มปกติ จะได้จากสัตว์ที่ยังไม่ได้ฉีด antigen เข้าไป ในสัตว์ที่มีภูมิคุ้มกัน การเกิด antibody เฉพาะ สามารถเพิ่มพูนเพื่อให้ได้ antiserum ที่มีคุณสมบัติเหนือกว่า (titre antiserum สูงขึ้นได้โดยใช้ adjuvants ช่วย
สัตว์ที่ใช้ในการเตรียม antiserum มีแกะ หนูตะเภา ไก่ กบ ม้า และกระต่าย การฉีด antigen จะฉีดเข้าที่เยื่อบุช่องท้อง (intraperitoneal) เส้นเลือด (intravenous) กล้ามเนื้อ (intramuscular) ใต้ผิวหนัง (subcutaneous) ของสัตว์ หรือฝ่าเท้าของกระต่าย (foot-pad) โดยการฉีดแต่ละครั้ง ใช้ประมาณ 0.01-2.0 มิลลิลิตร
Antigen ที่ฉีดเข้าไปจะสะสมในเซลของระบบ RE (reticular endothelial system) ของสัตว์ การเกิด antibody ส่วนใหญ่เป็นเซลพลาสมาที่มีอายุน้อย
วิธีการต่างๆ ในทางเซรุ่มวิทยาได้นำมาใช้กับวิสาสาเหตุโรคพืช เป็นครั้งแรกในปี ค.ศ. 1927 โดย M. Dvorak และคุณสมบัติเฉพาะของวิสา ปฏิกริยาทางเซรุ่มวิทยาได้ถูกพบเป็นครั้งแรกโดย H.P Beale เมื่อปี ค.ศ. 1928 ซึ่งต่อมายังได้แสดงให้เห็นว่ายาสูบที่เป็นโรคใบด่างเกิดจากวิสานั้น มีความเฉพาะของ antigen ของวิสา ที่ไม่พบในพืชต้นปกติ A. Gratia (1933) ได้รายงานว่า พืชที่เป็นโรคเกิดจากวิสาต่างชนิดกันจะมีความเฉพาะของแอนติเจนต่างกัน ต่อมา J.M. Birkeland ได้บรรยายไว้ในปี ค.ศ. 1934 ว่า Strain ที่แตกต่างกันของวิสาสาเหตุโรคพืชนั้น มีความเฉพาะซึ่งแตกต่างไปจาก strain อื่นๆ ในกลุ่มเดียวกันอีกด้วย
แบบของวิธีการทางเซรุ่มวิทยาที่ใช้ประโยชน์ในงานทางโรคพืช มีดังนี้
1. ปฏิกริยาแบบตกตะกอน (precipitation reaction)
การตกตะกอนจะเกิดขึ้นเมื่อวิสาถูกเติมด้วย antiserum เฉพาะของวิสานั้นในนํ้าเกลือ อัตราเจือจางต่างๆ แล้วฟักตัวใน water bath อุณหภูมิ 37° ซ.
การทดสอบตะกอนวงแหวน (ring interface test) โดยใส่เซรุ่มที่ก้นหลอดทดสอบที่มีขนาดเล็ก ค่อยๆ ริน antigen ลงไปในหลอดบนผิวเซรุ่มนั้นอย่างระมัดระวัง เพื่อให้เป็นชั้นมีการผสมกันน้อยที่สุด การกระจายของสารละลายทั้งสองจะเกิดขึ้นขณะฟักตัว ตะกอนวงแหวนจะเกิดขึ้น หาก antigen และ antibody มีความเข้มข้นพอเหมาะ ที่ระหว่างชั้นของสารละลายทั้งสอง การตรวจสอบวิธีนี้ไวมาก สามารถ ใช้ตรวจได้แม้ว่า antigen จะมีจำนวนเพียงเล็กน้อย
การทดสอบแบบ agglutination (agglulinationtest) โดยการหยดนํ้าคั้นของพืชที่เป็นโรค ลงบนสไลด์แล้วหยด antiserum ผสมลงไป จะเกิดตะกอนเหนียวขึ้น ซึ่งสามารถตรวจสอบได้ชัดเจนด้วยกล้องกำลังขยายตํ่าหรืออาจเห็นได้ด้วยตาเปล่า
การทดสอบแบบ microprecipitin (microprecipitin test) การทดสอบวิธีนี้สามารถใช้ได้แม้จะมี antigen หรือ antibody เพียงจำนวนเล็กน้อยมาก โดยทำใน mineral oil และใช้เวลฟักตัวนาน
การทดสอบแบบ Ouchterlony (Ouchterlony agar double-diffusion test)
โดยใส่ antigen และ antibody แยกกันลงในหลุมที่เตรียมขึ้นบนอาหารวุ้นในจานเลี้ยงเชื้อ ปล่อยให้สารละลายทั้งสองนั้น กระจายบนผิววุ้น ซึ่งอัตราของการกระจายนั้นขึ้นอยู่กับความหนาแน่น ความเข้มข้น และส่วนประกอบของวุ้นเมื่อ antigen และ antibody กระจายพบกัน จะเกิดโซนของตะกอนขึ้นเป็น band การทดสอบวิธีนี้ดีกว่าแบบอื่นๆ ที่สามารถทดสอบตัวอย่างที่มีการเจือจางในอัตราต่างๆ หรือจำนวนตัวอย่างชนิดต่างๆ พร้อมกันครั้งเดียวภายใต้สภาพที่เหมือนกัน
2. Neutralization
การใช้วิชาผสมกับ antibody ที่เตรียมขึ้นในการต่อต้านแล้ววิสานั้นจะสูญเสียความสามารถในการทำให้พืชติดเชื้อ
3. Complement-fixation
การใช้เซรุมปกติเป็น complement ใส่ลงไปในปฏิกริยาของ antibody และ antigen สาร complement จะถูกปฏิกริยานั้น fix เป็นบางส่วน ฉะนั้นการตรวจสอบปฏิกริยาจะได้จากการวัดปริมาณของcomplement ที่เหลือจากปฏิกริยา (complement เป็นส่วนประกอบที่มีอยู่ในเซรุ่มปกติ สลายตัวเมื่อถูกความร้อน)
การวัดปริมาณของ complement ที่เหลือ โดยทิ้งไว้ประมาณหนึ่งชั่วโมง แล้วเติมเม็ดเลือดแดงของแกะ (ที่ผ่านการล้างแล้ว) และ haemolytic amboceptor ผสมกัน เก็บไว้ที่อุณหภูมิ 77°ซ. ตรวจเป็น ระยะๆ โดยดูระดับการสลายตัวของเม็ดเลือด
สำหรับ haemolytic amboceptor เป็น antiserum จากกระต่ายที่ฉีดด้วยเลือดแกะ แล้วผ่านการให้ความร้อนที่อุณหภูมิ 56°ซ. เพื่อให้ปลอดจาก complement
(1) ตัวอย่าง antigen + antibody + complement = ถูก fix หมด (2) ตัวอย่าง antigen + antibody + complement =
complement ถูก fix เพียงบางส่วน
(1) + haemolytic amboceptor + เม็ดเลือด = ไม่มีเม็ดเลือดสลายตัว
(2) + haemolytic amboceptor + เม็ดเลือด = มีเม็ดเลือดสลายตัว
การทดสอบวิธีนี้ค่อนข้างยุ่งยาก จึงไม่ใคร่นิยมใช้ในงานทางวิสาสาเหตุโรคพืช

ภาพการทดสอบทางเซรุ่มวิทยา A) microprecipition และ B) Ouchterlony doublediffusion tests.(ที่มา:Agrios, 1978)
ที่มา:ไพโรจน์  จ๋วงพานิช